Es la segunda vez que el legislativo británico rechaza respaldar los términos de la escisión del bloque comunitario.
"Si este voto no prospera, el Brexit puede perderse", advirtió la jefa del Ejecutivo conservador en el debate previo.
Los Comunes rechazaron el revisado acuerdo por 391 votos contra 242.
Esta próxima votación, que será determinante para proceder con el Brexit en la fecha prevista del 29 de marzo, estará libre de la habitual disciplina de los respectivos partidos parlamentarios.
"Es una cuestión de grave importancia para nuestro país y, al igual que en el referéndum (de la UE), hay fuertes y encontradas opiniones en ambos lados de la Cámara", afirmó May con la voz entrecortada por una aguda afonía.
Si los Comunes votan en contra de un Brexit sin acuerdo con la UE, el Gobierno presentará el 14 de marzouna moción con la opción de prorrogar la salida.
"Siento apasionadamente que marchar ordenadamente con un acuerdo es la mejor vía", señaló la dirigente conservadora.
El líder laborista, Jeremy Corbyn pidió elecciones generales anticipadas en respuesta a la nueva derrota parlamentaria del Gobierno May.
La versión original del pacto, sellada en el Consejo Europeo en noviembre de 2018, fue rechazada por los Comunes el pasado 15 de enero en la derrota más descomunal acusada por un Gobierno en la historia moderna del Reino Unido.
En esa primera votación del acuerdo consiguió el apoyo de 202 parlamentarios frente a 432 votos en contra.
Esta nueva derrota del plan de la primera ministra deja al Parlamento británico la opción de exigir al Gobierno la posibilidad de retrasar la salida de la UE o de ejecutar el Brexit duro y desordenado el próximo 29 de marzo.
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La propia May advirtió tras la votación de este 12 de marzo que si se decide aplazar el Brexit, ello "no resolverá los problemas existentes".
"El Parlamento debe responder la pregunta de si desea retirar la solicitud de salida de la UE, si quiere un segundo referéndum o si quiere una salida acordada pero con otro acuerdo", dijo la líder conservadora.